Etat des connaissances

Hémophilie

DÉFINITION

 

L’hémophilie est une maladie hémorragique chronique consécutive à une mutation touchant le gène du facteur VIII (FVIII) de la coagulation (hémophilie A) ou du facteur IX (FIX, hémophilie B). La transmission génétique de cette maladie est récessive et liée à l’X, les 2 gènes étant localisés sur le bras long de ce chromosome. L’incidence de l’hémophilie A est d’environ 1/7500 naissances de sexe masculin et celle de l’hémophilie B d’1/30 000. Cette maladie touche essentiellement les garçons alors que les femmes porteuses d’une mutation sur l’un de leurs 2 chromosomes X sont dites conductrices et la plupart du temps leur taux plasmatique intermédiaire est suffisant pour leur éviter des manifestations hémorragiques, du moins dans le cadre de la vie courante. Toutefois, certaines femmes présentent un taux extrêmement bas en raison d’évènements génétiques particuliers (lyonisation extrême du chromosome X) et leurs signes hémorragiques peuvent être tout à fait significatifs. Les progrès saisissants de la génétique ces 30 dernières années ont permis d’élaborer des outils d’analyse permettant de reconnaître ces évènements rares, mais aussi de façon beaucoup plus fréquente de reconnaître les mutations sur les gènes concernés, de pouvoir suivre la transmission du gène muté dans une famille et de proposer une possibilité de diagnostic prénatal.

 

CLINIQUE

 

L’expression phénotypique de l’hémophilie est variable et on distingue plusieurs formes cliniques selon la valeur procoagulante des molécules déficitaires : forme sévère (taux de FVIII ou de FIX < 1% ou 1 unité/dL), forme modérée (activité coagulante comprise entre 1 et 5%) et forme mineure (activité comprise entre 5 et 40%). En l’absence de traitement préventif, les accidents hémorragiques surviennent de façon pluri-mensuelle dans le cadre de la vie courante dans les formes majeures et sont plutôt post-traumatiques ou per- et post-opératoires dans les formes modérées et mineures.

La grande majorité des accidents hémorragiques touche les articulations et les muscles, ce qui provoque progressivement des dégâts musculo-articulaires considérables, responsables d’une pathologie extrêmement invalidante appelée arthropathie hémophilique. Néanmoins, toute cavité et  tout organe peut être le siège d’un accident hémorragique. En l’absence de traitement, l’espérance de vie d’un hémophile sévère était au début du XXème siècle d’une dizaine d’années. Aujourd’hui, les traitements modernes permettent aux hémophiles d’avoir une espérance de vie qui s’approche de celle de la population contrôle, ce qui témoigne des progrès considérables de la prise en charge médicale de cette affection.

 

TRAITEMENT 

 

Après l’utilisation du sang total puis du plasma, l’industrie a progressivement réussi à purifier les molécules de FVIII et de FIX à partir du plasma humain à l’aide de différentes techniques chromatographiques. Le milieu du début des années 1980 a permis le clonage des 2 gènes et quelques années plus tard l’industrie pharmaceutique a réussi à fabriquer du facteur VIII puis du facteur IX recombinant. Aujourd’hui ces facteurs recombinants occupent une position prédominante pour le traitement des hémophiles. Toutefois, des résultats contradictoires issus de travaux multinationaux existent  depuis plusieurs années concernant l’immunogénicité des facteurs VIII recombinants et plasmatiques. En effet, depuis la transmission de virus pathogènes (VIH, virus des hépatites B et C) par les concentrés plasmatiques avant 1985, la complication la plus fréquente du traitement préventif ou curatif par FVIII est le développement d’anticorps dirigés contre ce facteur qui peuvent, si leur titre est élevé, considérablement compliquer le  traitement substitutif par facteur VIII. Cette réaction immunitaire, qui survient chez environ 30% des patients atteints d’hémophilie A sévère, est moins fréquente dans les formes modérées et mineures ainsi que dans l’hémophilie B.

L’utilisation des  concentrés de facteurs de coagulation chez l’hémophile sans anticorps est fondée sur le principe de la substitution spécifique du facteur déficitaire. Des injections intraveineuses lentes, aujourd’hui de quelques millilitres, sont réalisées soit en prévention des saignements (on parle de traitement prophylactique), soit pour faire céder une hémorragie en cours (on parle dans ce cas de traitement à la demande).

Le traitement prophylactique est aujourd’hui le plus utilisé dans les pays dont le niveau économique est fort. Son principe est de transformer un hémophile sévère en hémophile modéré sans que le facteur VIII ou le facteur IX ne retourne à son niveau de base. Un tel traitement, s’il est bien conduit, permet d’éviter une très grande partie des accidents hémorragiques, en tout cas ceux qui pourraient apparaitre dans la vie courante. Il est ainsi possible de diminuer la fréquence des hémarthroses et des hématomes et partant, de préserver le capital musculo-articulaire et de favoriser l’insertion sociale et professionnelle des patients hémophiles. Un apprentissage de la maladie, de ses conséquences et de la manière de les prévenir, est aujourd’hui dispensé dans le cadre de l’éducation thérapeutique des patients, dont l’un des objectifs est de les rendre autonomes pour réaliser leurs injections intraveineuses pluri-hebdomadaires à domicile ou sur le lieu du travail. Les caractéristiques pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des facteurs de coagulation actuels imposent en effet la plupart du temps de réaliser 2 à 3 administrations hebdomadaires.

En cas de développement d’anticorps anti-facteur VIII, on tente généralement de les faire disparaitre par des administrations régulières de fortes doses du facteur de coagulation manquant (on qualifie cette pratique d’induction de tolérance immune), mais dans environ 30% des cas d’inhibiteurs anti-FVIII, ce traitement lourd et coûteux est un échec. On peut dans ce cas avoir recours à des agents dits bypassants, car permettant d’obtenir une hémostase dans plus de 80% des cas en court-circuitant l’étape où  le facteur VIII et le facteur IX interviennent.

La mise sur le marché progressive de ces médicaments s’est également accompagnée d’une structuration de l’offre de soins au sein de Centres de Traitement de l’Hémophilie comportant des équipes médicales dédiées à la prise en charge de ces pathologies hémorragiques, principalement localisées dans les CHU, puis plus récemment un Centre de Référence National  est venu compléter ce dispositif régional, avec pour mission de coordonner et de promouvoir ces activités médicales et scientifiques.

Nous nous trouvons à l’heure actuelle dans une phase de révolution de nos schémas thérapeutiques pour plusieurs raisons : après un développement réussi, des produits à demi-vie allongée vont faire leur apparition prochainement, ayant une efficacité thérapeutique au moins identique aux molécules conventionnelles, mais permettant d’espacer  les injections intraveineuses de façon très significative pour le facteur IX et moins marquante pour le facteur VIII. D’autre part, plusieurs essais cliniques de thérapie génique sont en cours, utilisant une seule injection intraveineuse d’un vecteur viral recombinant véhiculant le gène du facteur VIII ou du facteur IX, après le succès de l’injection intraveineuse unique d’un adénovirus associé transportant le gène du facteur IX en 2011.

Enfin, des approches non conventionnelles pour suppléer au défaut de coagulation sont en cours de développement dans le cadre d’essais cliniques internationaux. Ces nouvelles approches utilisent la possibilité de remplacer une fraction (5 à 15% aujourd’hui) de l’activité du facteur VIII par un anticorps monoclonal qui permet de fixer et de rapprocher dans l’espace les facteurs IXa et X, ce qui induit une activation du facteur X et la suite des réactions de coagulation. Cet anticorps monoclonal a l’énorme avantage d’être administré par voie sous-cutanée avec un objectif d’une injection par semaine voire peut-être moins, afin de maintenir un plateau plasmatique d’activité biologique équivalant à 5 à 15% de facteur VIII. Une autre approche consiste à injecter par voie sous-cutanée un ARN interférant qui cible spécifiquement l’ARN messager de l’antithrombine dans les cellules hépatiques et ainsi permet de diminuer de plus de 60% l’antithrombine produite par le foie. Ce concept  tout à fait innovant, s’appuyant sur des données précliniques solides, utilise la régulation du système de coagulation par les inhibiteurs physiologiques dont le plus puissant est l’antithrombine. Les phases I/II pour ces 2 molécules candidates sont terminées et les résultats favorables obtenus vont permettre de démarrer la phase III du développement clinique. Une approche similaire vise à inhiber, au moyen d’un anticorps monoclonal, l’activité du TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) circulant dans le plasma, qui est un autre inhibiteur de la coagulation.

Ainsi, ces molécules mettent à profit l’équilibre délicat entre la composante procoagulante et la composante anticoagulante de la coagulation, permettant en quelque sorte de restaurer l’équilibre de la balance entre les 2 systèmes en cas de déficit de la composante procoagulante lors d’hémophilie. Toutefois, il faudra attendre la fin des essais cliniques de phase III pour être certain de l’efficacité et de la tolérance de ces produits. Il s’agit donc bel et bien d’une révolution thérapeutique qui est en train de se profiler et dont les patients devraient tirer un bénéfice significatif.

 

Déficits congénitaux en facteurs de la coagulation

 

Synonyme

Déficit constitutionnel en Facteur II, V, VII, X, XI, XII, XIII ou en fibrinogène.
 

Définition

Diminution héréditaire en facteur de la coagulation.
 

Clinique

Les déficits héréditaires en facteurs de la coagulation en dehors de l'hémophilie sont des pathologies rares. Ils ont un certain nombre de points communs : transmission autosomale récessive sauf pour le déficit en Facteur XI, déficits quantitatifs et souvent qualitatifs. Le syndrome hémorragique est le plus souvent corrélé au déficit biologique surtout pour les déficits sévères homozygotes. Chez les hétérozygotes, les signes cliniques peuvent être modérés ou absents.
Quelques particularités :
- les déficits en Facteur XII, prékallicréine et kininogène de haut poids moléculaire sont sans conséquence hémorragique;
- pour les déficits en Facteurs V et XI, l'intensité du saignement semble mieux corrélée au contenu plaquettaire qui est toutefois difficile à évaluer;
- le bilan standard de coagulation est normal en cas de déficit en Facteur FXIII : il faut effectuer un dosage spécifique de ce facteur.
 

Diagnostic

Le diagnostic biologique repose sur l'allongement du temps de Quick (Facteurs II, V, VII et X), l'allongement du temps de thrombine (fibrinogène) ou du temps de céphaline activée (tous les facteurs sauf le Facteur VII). Le dosage spécifique du facteur affirme le déficit.
Comme noté ci-dessus, le déficit en Facteur XIII ne peut être mis en évidence que par son dosage spécifique.
 

Traitement

Tous les facteurs de la coagulation peuvent être administrés sous forme de concentrés, à l'exception du Facteur V. Dans ce cas particulier, le traitement substitutif consiste en la transfusion de plasma frais congelé.
Les déficits modérés en Facteur XI peuvent également être traités par anti-fibrinolytiques (acide tranexamique).
 

Maladie de Willebrand

Agnès Veyradier, sous l’égide du CRMR de la Maladie de Willebrand

Ce texte est largement extrait de la revue générale suivante : Veyradier A, Fressinaud E, Goudemand J, Meyer D. La maladie de Willebrand. Hématologie 2011 ; 17 :278-288.

Il a été actualisé avec les données récemment publiées par le CRMR de la Maladie de Willebrand: Veyradier A, Boisseau P, Fressinaud E, Caron C, Ternisien C, Giraud M, Zawadzki C, Trossaert M, Itzhar-Baikian N, Dreyfus M, d’Oiron R, Borel-Derlon A, Susen S, Bezieau S, Denis CV, Goudemand J, French Reference Center for von Willebrand disease. A laboratory phenotype/genotype correlation of 1167 French patients from 670 families with von Willebrand disease: a new epidemiologic picture. Medicine (Baltimore) 2016; 95: e3038.

La Maladie de Willebrand

 


Le point commun à toutes les formes de maladie de Willebrand (VWD) est l’existence d’un déficit quantitatif et/ou qualitatif en facteur Willebrand (VWF), une glycoprotéine jouant un rôle clé dans l’hémostase. Aujourd’hui, la VWD est définie comme toute pathologie hémorragique causée par un défaut génétique de la concentration, la structure ou la fonction du VWF, que l’anomalie moléculaire soit située au niveau du gène du VWF ou sur d’autres gènes dits modulateurs [1]. La VWD est caractérisée par une très grande hétérogénéité clinique, biologique et moléculaire. Sa transmission génétique se fait sur un mode autosomique, le plus souvent dominant. Dans moins de 5% des cas de tous les déficits en VWF, il ne s’agit pas d’une VWD constitutionnelle mais d’un syndrome de Willebrand acquis par le biais de divers mécanismes (le plus fréquent étant le développement d’un auto-anticorps dirigé contre le VWF).

Toutes formes confondues c’est-à-dire des formes les plus frustes jusqu’aux formes les plus sévères, la prévalence de la VWD est élevée, de l’ordre de 1% de la population générale [2]. En revanche, les estimations basées sur la prise en charge des formes symptomatiques (manifestations hémorragiques ayant nécessité une hospitalisation et le plus souvent, un traitement par médicaments dérivés du sang) indiquent une prévalence d’environ 100 cas par million (soit 0,01%), ce qui est similaire à la prévalence de l’hémophilie A [3]. Au sein de ces formes symptomatiques de VWD, la prévalence de la forme sévère (déficit total en VWF, de transmission récessive) est de l’ordre d’1 cas par million (soit 0,0001%). En France, on estime que 7000 à 8000 patients ont une forme symptomatique de VWD incluant 50 à 100 patients avec la forme la plus sévère. Le premier Plan National Maladies Rares mis en œuvre par le Ministère de la Santé français a labellisé en 2006 un Centre National de Référence de la Maladie de Willebrand (CRMW) dont une des missions a été de mettre en place une plate-forme de diagnostic phénotypique et génotypique dédiée aux formes les plus graves de VWD. La VWD figure parmi les 2500 maladies rares répertoriées dans Orphanet.

Fonctions du facteur Willebrand dans l’hémostase

Le VWF a 2 grandes fonctions : 1/ le VWF permet l’adhésion des plaquettes à la paroi vasculaire lésée grâce à ses sites de liaison pour la GPIb plaquettaire et le collagène ; il facilite aussi l’agrégation des plaquettes entre elles grâce à son interaction avec la GPIIb/IIIa. L’organisation multimérique du VWF a une conséquence directe sur cette fonction puisque son pouvoir adhésif vis-à-vis du sous-endothélium et des plaquettes est proportionnel à la taille des multimères. En outre, ce rôle du VWF est primordial dans les conditions hémorrhéologiques de la microcirculation où le taux de cisaillement du flux sanguin est élevé; 2/ le VWF est la protéine porteuse du FVIII et le protège ainsi d’une protéolyse plasmatique rapide (ce qui permet au FVIII d’avoir une demi-vie de 12 à 20 heures) [4, 5].

Les concentrations normales de VWF dans le plasma ont une distribution large, variant de 50 UI/dl jusqu’à 200 UI/dl. De nombreux facteurs tant génétiques qu’environnementaux, influencent ces taux. Le groupe sanguin ABO influence largement le taux de VWF dans le sang circulant, les sujets de groupe O ayant des taux environ 25% inférieurs à ceux de groupe non O [6]. Les sujets noirs ont des taux de VWF plus élevés d’environ 15% par rapport aux autres ethnies [7]. L’âge influence également le taux de VWF qui s’élève à la naissance puis diminue progressivement jusqu’à l’âge de 6 mois, puis augmente d’environ 10 UI/dl par décennie. Les hormones oestroprogestatives modifient le taux de VWF : pendant le cycle menstruel, les taux les plus faibles sont atteints lors des règles et les plus élevés lors de la phase lutéale [8] ; la pilule contraceptive n’augmente que modestement le taux de VWF [9] ; le VWF augmente progressivement tout au long de la grossesse pour atteindre, à terme,  des valeurs multipliées par 3 par rapport au taux basal [10]. Le taux de VWF peut également être transitoirement augmenté par le stress et l’exercice physique, ou encore être multiplié par un facteur 2 à 5 lors des pathologies inflammatoires au sens large du terme (infections, inflammation chronique, malignité) ou lors du diabète, de l’insuffisance rénale ou d’hépatopathies [11].

Stratégie du diagnostic biologique de maladie de Willebrand

L'evaluation biologique initiale

Comme pour tout syndrome hémorragique, l’évaluation biologique initiale d’un patient pour lequel le diagnostic de VWD est évoqué comprend au minimum un hémogramme avec numération des plaquettes, un temps de Quick et un temps de céphaline avec activateur (TCA), souvent complétés par le temps de thrombine et le dosage du fibrinogène. Cette évaluation initiale ne permet en aucun cas d’affirmer ou d’exclure le diagnostic de VWD (par exemple, le TCA est ainsi normal dans de nombreux cas de VWD). Elle a pour but d’orienter éventuellement vers un déficit en facteur de la coagulation ou d’objectiver une thrombopénie pouvant être impliqués dans le syndrome hémorragique. Certains centres réalisent aussi un temps de saignement (TS) ou une mesure du temps d’occlusion plaquettaire (TO) sur l’automate PFA-100®, tests qui permettent une exploration globale de l’hémostase primaire. Dans la VWD, la sensibilité du TS n’est que de 50 à 60% alors que celle du TO PFA-100® est de 90% [12]. Enfin, la notion de groupe sanguin ABO est souvent documentée dès la première consultation car elle permet de mieux interpréter les taux plasmatiques de VWF (cf infra).

Les examens phénotypiques de premier niveau

Les examens phénotypiques de premier niveau à réaliser pour le diagnostic biologique de VWD doivent être demandés dans le cadre d’une consultation spécialisée ; ils sont au nombre de trois et ne doivent pas être dissociés : 1/ le dosage de l’antigène du VWF plasmatique (VWF:Ag), 2/ le dosage de l’activité cofacteur de la ristocétine du VWF (VWF:RCo), test fonctionnel qui mesure la capacité du VWF à se lier aux plaquettes en présence de ristocétine, 3/ le dosage du FVIII coagulant (FVIII :C) qui évalue indirectement la capacité du VWF à transporter et à maintenir le FVIII dans la circulation. L’interprétation des résultats nécessite la connaissance du contexte clinique (syndrome inflammatoire, grossesse…). Les résultats sont exprimés en UI/dl. L’infirmation ou l’affirmation du diagnostic repose sur au moins deux déterminations réalisées à deux occasions. Le test d’agrégation plaquettaire induite par la ristocétine (ristocetin-induced aggregation, RIPA) a essentiellement pour but de déceler un variant particulier de VWD caractérisé par une hyperaffinité du VWF pour la GPIb plaquettaire (type 2B, cf infra). Nous recommandons de le considérer comme un test de premier niveau afin de ne pas méconnaitre certains cas particuliers de ce variant de VWD où les taux de VWF et de FVIII sont normaux.

Le seuil en dessous duquel le diagnostic de VWD est certain est extrêmement discuté, en particulier pour les déficits quantitatifs partiels (type 1, cf infra). Le consensus britannique [13] retient que le diagnostic de type 1 est possible pour des taux de VWF:Ag et VWF:RCo inférieurs à 50 UI/dl à 2 reprises (sans considération d’âge ou de groupe ABO). Le consensus américain [14] recommande un seuil de 30 UI/dl au dessous duquel le diagnostic de VWD de type 1 est certain, en s’appuyant sur les observations suivantes : de nombreux sujets de groupe sanguin O ont des taux de VWF inférieurs à 50 UI/dl ; aucune anomalie du gène du VWF n’est identifiée chez la grande majorité des sujets ayant un taux de VWF supérieur à 30 UI/dl ; chez les sujets ayant un taux de VWF entre 30 et 50 UI/dl, c’est finalement sur des arguments cliniques et familiaux que le diagnostic de VWD pourra être retenu. L’analyse des rapports VWF:RCo/VWF:Ag et FVIII:C/VWF:Ag doit être réalisée systématiquement puisqu’elle permet de s’orienter vers le type de déficit (quantitatif ou qualitatif). La pertinence de ces ratios est limitée par le taux de VWF:Ag qui, s’il est inférieur à 15 UI/dl, peut mettre leur valeur informative en défaut. Un rapport VWF:RCo/VWF:Ag abaissé (le seuil discriminatif de 0,6 ou 0,7 reste discuté [15]) est en faveur d’une anomalie qualitative d’interaction du VWF avec les plaquettes ; un rapport FVIII:C/VWF:Ag abaissé (inférieur à 0,6) peut être en relation avec une anomalie d’interaction du VWF avec le FVIII (variant particulier de VWD appelé 2N, cf infra) ou avec une hémophilie A modérée ou mineure.

Les examens phénotypiques de deuxième niveau

Les examens phénotypiques de deuxième niveau pour le diagnostic de VWD comprennent le dosage de la capacité de liaison du VWF au collagène (VWF:CB), l’étude de la liaison du VWF aux plaquettes en présence de ristocétine, l’étude de la liaison du VWF au FVIII (VWF:FVIIIB), l’analyse de la distribution multimérique du VWF, le dosage du propeptide du VWF (VWFpp). Une sélection de ces tests doit être réalisée si au moins l’un des critères suivants est présent à l’issue des examens de premier niveau : un rapport VWF:RCo/VWF:Ag est inférieur à 0,6-0,7, un rapport FVIII:C/VWF:Ag est inférieur à 0,6, un test RIPA est positive pour une concentration de ristocétine inférieure à 0,8 mg/ml, un taux de VWF:RCo et/ou de VWF:Ag inférieur à 30 UI/dl (ou de 30-50 UI/dl avec des arguments cliniques ou familiaux en faveur d’une VWD). Le dosage du VWF:CB et l’analyse des multimères du VWF sont réalisés dans presque tous les cas. L’étude de la liaison du VWF aux plaquettes est principalement réalisée chez les patients ayant une RIPA positive aux faibles concentrations de ristocétine. Le VWF:FVIIIB est réalisé chez tous les patients ayant un rapport FVIII:C/VWF:Ag inférieur à 0,6. Le dosage du VWFpp est essentiellement réalisé chez les patients ayant un profil de type 1 afin d’identifier ceux qui ont une clairance accélérée.

L’étude génotypique

L’étude génotypique des patients atteints de VWD est réalisée en France uniquement chez les patients ayant un profil phénotypique justifiant leur inclusion dans la base de données du CRMW afin d’optimiser la détection de mutations à pénétrance complète. Le séquençage direct de l’ADN du VWF (52 exons) est la méthode de référence pour la détection des mutations [16]. L’analyse moléculaire permet en effet d’établir des corrélations phénotype/génotype qui sont importantes pour la prise en charge du patient. Très souvent, la biologie moléculaire est aussi une aide précieuse à la caractérisation du type de VWD [16, 17]. Enfin, c’est sur cette analyse que s’appuie le conseil génétique, particulièrement dans les familles où il existe un risque de VWD de type 3.

Manifestations cliniques de la maladie de Willebrand

Les manifestations cliniques de la VWD sont principalement des hémorragies de la peau et des muqueuses (épistaxis, gingivorragies, ecchymoses, ménorragies, hémorragies gastro-intestinales, hémorragies du post-partum…) et des saignements prolongés après une procédure avec effraction vasculaire, même mineure. Les hémorragies des tissus profonds et les hémarthroses sont très rares, sauf chez les patients atteints de la forme sévère récessive (type 3, cf infra). Dans la majorité des cas, l’expression clinique de la VWD est modérée sauf chez les patients atteints de la forme la plus sévère (type 3) et chez certains variants (type 2 ou déficits qualitatifs) où certaines hémorragies peuvent menacer le pronostic vital (hémorragie du système nerveux central, amygdalienne ou digestive notamment par angiodysplasie). Généralement, la sévérité clinique est corrélée au taux de VWF et de FVIII.

L’interrogatoire doit recueillir les caractéristiques de chaque symptôme hémorragique (spontanéité, localisation, taille, fréquence, durée, sévérité) et il doit également préciser les « challenges » hémorragiques auxquels le patient a été soumis (extraction dentaire, procédure invasive, accouchement…), la notion d’anémie ferriprive et les antécédents transfusionnels. Les antécédents hémorragiques familiaux seront recueillis de manière analogue et un arbre généalogique détaillé sera établi. Depuis quelques années, des outils permettant de quantifier le syndrome hémorragique de la façon la plus objective possible ont été développés [18, 19]. Le document le plus abouti est le score hémorragique développé par Tosetto et al [19] qui propose d’attribuer une cotation de -1 à +4 à 12 items correspondant à diverses manifestations hémorragiques. Chez les sujets sains, le score hémorragique est toujours inférieur à 4. Chez les sujets atteints de VWD, il y a une forte corrélation négative entre les taux plasmatiques de VWF et de FVIII et le score hémorragique. En outre, ce score est encore plus prédictif du risque hémorragique que les taux de VWF [19].

Diagnostic positif de maladie de Willebrand : critères clinico-biologiques et difficultés

Les experts internationaux ont proposé que le diagnostic de VWD repose sur l’association de 3 critères [18, 20] : 1/ l’existence d’une symptomatologie hémorragique depuis l’enfance, 2/ un taux de VWF diminué c’est-à-dire inférieur au taux moyen – 2DS d’une population normale de groupe ABO apparié, 3/ l’existence d’une symptomatologie hémorragique dans la famille traduisant la transmission autosomique du phénotype.

Ces critères permettent le plus souvent de diagnostiquer sans problème le type le plus sévère de la maladie (type 3), la majorité des variants (type 2) et les déficits quantitatifs partiels les plus importants (type 1 dont le taux de VWF est inférieur à 30 UI/dl). Mais il existe clairement un chevauchement à la fois du phénotype clinique et du phénotype biologique entre des sujets porteurs des formes les plus modérées de VWD et des sujets sains [20, 21], ce qui pose, en pratique, un problème diagnostique pour les sujets ayant des taux de VWF compris entre 30 et 50 UI/dl.  De manière intéressante, les études de grandes cohortes européennes [22] et canadiennes [23] ont montré que pour la majorité des patients ayant des taux de VWF modestement diminués, ni la symptomatologie hémorragique ni le taux de VWF ne sont associés au locus du gène du VWF. Récemment, un modèle statistique s’appuyant sur le théorème de Bayes [24] et consistant en une approche probabiliste prenant en compte le score hémorragique et le taux de VWF du patient et des membres de sa famille potentiellement atteints permet de calculer une probabilité finale d’être atteint de VWD de type 1. Cet outil n’est pas applicable en pratique clinique quotidienne mais il a le grand mérite de souligner qu’il existe une « zone grise » où le diagnostic de VWD ne peut être porté formellement et que l’affirmer présente plus de désavantages que de bénéfice pour le patient. Dans ce cadre particulier, il est donc préférable de reconnaitre chez le patient un facteur de risque de saignement (à prendre en compte en cas d’acte vulnérant) plutôt qu’une véritable VWD.

Classification de la maladie de Willebrand

La mise à jour la plus récente de la classification de la VWD reconnait 6 types différents, dont 3 « grands types » : type 1 (déficit quantitatif partiel), type 2 (déficits qualitatifs ou variants moléculaires subdivisé en 4 types : 2A, 2B, 2M et 2N) et type 3 (déficit quantitatif total) [1]. Les principales caractéristiques des 6 types de VWD sont synthétisées dans le texte suivant.

Maladie de Willebrand type 1

Le type 1 est lié à un déficit quantitatif partiel en VWF dont la transmission génétique est dominante mais dont la pathogénie demeure complexe (Figure 3). Classiquement, c’est le plus fréquent représentant 50 à 75% des formes de la VWD. La symptomatologie hémorragique est liée à la concentration diminuée de VWF (qualitativement normal) dans la circulation (Tableau 2). Lorsque le taux de VWF est inférieur à 30 UI/dl, on sait que deux grands mécanismes sont le plus souvent à l’origine du type 1 : soit un défaut de sécrétion du VWF [25] soit une clairance accélérée du VWF dans la circulation [1]; ces taux très nettement inférieurs à 50 UI/dl sont expliqués par un effet dominant négatif de la mutation en cause sur la sous-unité normale de VWF : en effet, seuls les homodimères non mutés sont sécrétés car la mutation causale affecte le transport intracellulaire et donc la sécrétion du VWF. Lorsque le taux de VWF est compris entre 30 et 50 UI/dl, il n’est généralement pas retrouvé de mutations au niveau du gène du VWF ce qui implique que d’autres loci génétiques (entre autres, le groupe sanguin ABO) sont impliqués dans la régulation de l’expression du VWF. Fait important, le spectre des mutations au niveau du gène du VWF responsables de VWD de type 1 (mutations décrites sur toute la longueur du gène) est différent de celui de la VWD de type 3 (où les mutations sont responsables d’un allèle silencieux) : ainsi, un sujet atteint de VWD de type 1 n’est pas équivalent à un statut d’hétérozygote pour une mutation de type 3.

Le diagnostic de type 1 peut être porté facilement lorsque les critères suivants sont associés : taux de VWF inférieurs à 30 UI/dl avec des taux de VWF:Ag, VWF:RCo, VWF:CB parallèles et un ratio FVIII/VWF:Ag supérieur à 0,7, RIPA négative pour les concentrations de ristocétine inférieures à 0,8 mg/ml, distribution multimérique normale. Le ratio VWFpp/VWF:Ag permet d’orienter vers le mécanisme : lorsqu’il est significativement élevé (supérieur à 4), il témoigne d’une accélération de la clairance du VWF. Le diagnostic de type 1 est beaucoup plus difficile pour des taux de VWF supérieurs à 30 UI/dl (avec tous les critères précédents), la probabilité étant faible pour des taux supérieurs à 40 UI/dl. Dans la zone grise des taux compris entre 30 et 40 UI/dl, le taux est à considérer comme d’autant plus pathologique que le sujet est âgé, de groupe sanguin non O et qu’il existe une symptomatologie hémorragique personnelle et/ou familiale.

Maladie de Willebrand type 2A

Le type 2A inclut les variants avec une diminution d’affinité du VWF pour les plaquettes (et le sous-endothélium) qui est liée à un défaut en multimères de haut PM du VWF. Le mécanisme le plus fréquemment responsable du type 2A correspond à la présence de mutations localisées dans le domaine A2 du VWF (type 2A(IIA)) qui induisent une hypersensibilité des multimères de VWF (normalement sécrétés) à la protéolyse par ADAMTS13 (groupe 2) ; dans certains cas, s’associe une biosynthèse anormale des multimères (groupe 1). D’autres mécanismes plus rares peuvent également être responsables du type 2A de VWD avec des mutations localisées dans d’autres domaines du VWF. Pour la majorité des variants 2A (à l’exception du 2A(IIE)), le diagnostic biologique repose sur les critères suivants : des rapports VWF:RCo/VWF:Ag et VWF:CB/VWF:Ag toujours inférieurs à 0,6, une absence de RIPA pour toute concentration de ristocétine inférieure à 0,8 mg/ml, une absence de multimères de haut PM et souvent aussi de multimères de PM intermédiaires.

Maladie de Willebrand type 2B

Le type 2B regroupe les variants ayant une augmentation de l’affinité du VWF pour la GPIbα plaquettaire : le VWF est normalement synthétisé, multimérisé et sécrété mais des mutations au niveau de son domaine A1 responsables d’une modification conformationnelle le rendant hyperaffin pour la GPIbα, lui permettent de se lier spontanément aux plaquettes. Ceci explique la perte des multimères de HPM (qui sont adsorbés à la surface des plaquettes) et la thrombopénie observée chez certains patients. Parallèlement à la forme typique du variant 2B, il existe des subtilités phénotypiques liées soit à certaines mutations du domaine A1 (type 2B « New York » ou « Malmö » dont le phénotype est voisin de celui d’un type 1) soit à l’existence concomitante d’une anomalie de la mégacaryocytopoïèse (syndrome de « Montréal » où il existe une thrombopénie profonde, tardivement reconnue comme VWD de type 2B). Le diagnostic de type 2B est facilement évoqué dans les formes typiques devant une thrombopénie fluctuante, des rapports VWF:RCo/VWF:Ag et VWF:CB/VWF:Ag inférieurs à 0,7 et surtout l’existence d’une RIPA paradoxale à une concentration de ristocétine inférieure à 0,7 mg/ml. Ces caractéristiques phénotypiques sont également rencontrées dans une thrombopathie appelée « pseudo maladie de Willebrand » liée à des mutations de la GPIbα (5% des patients ayant un phénotype évocateur de type 2B de VWD seraient en fait atteints de cette thrombopathie); seule l’analyse moléculaire du gène du VWF permet définitivement de trancher en faveur d’un type 2B de VWD si des mutations du domaine A1 sont retrouvées. Dans le cas contraire, le séquençage du gène de la GPIbα est alors indiqué.

Maladie de Willebrand type 2M

Le type 2M regroupe les variants ayant un défaut de liaison du VWF aux plaquettes ou au collagène, indépendamment de la structure multimérique du VWF (ou autrement dit, qui n’est pas lié à un défaut de multimérisation du VWF mais au contraire à un effet direct de la mutation). Les mécanismes font intervenir des mutations du domaine A1 (domaine de liaison à la GPIbα) ou du domaine A3 (domaine de liaison au collagène) du VWF. Ainsi, on distingue 2 sous-groupes : quand les mutations sont localisées dans le domaine A1 du VWF, le ratio VWF:RCo/VWF:Ag est inférieur à 0,7 alors que le ratio VWF:CB/VWF:Ag est normal ou subnormal et la structure multimérique est normale ou peut présenter une perte relative des multimères de HPM avec un « smear » (flou du tracé électrophorétique) ayant amené certains équipes à les décrire comme 2M « 2A-like » ; quand les mutations sont localisées dans le domaine A3, le ratio VWF:RCo/VWF:Ag est normal alors que le ratio VWF:CB/VWF:Ag est inférieur à 0,7 et la structure multimérique subnormale avec présence d’un « smear ».

Maladie de Willebrand type 2N

Le type 2N regroupe les variants ayant un défaut de liaison du VWF au FVIII. Ce variant a la particularité d’être transmis sur un mode récessif ce qui signifie que les patients sont soit homozygotes, soit hétérozygotes composites, soit hémizygotes (association d’un allèle 2N avec un allèle silencieux, type 2N/3). Le mécanisme repose sur un effet fonctionnel direct de mutations localisées dans les domaines D’ et D3 du VWF. Les patients se présentent avec un phénotype similaire à celui d’un hémophile A modéré ou mineur, le ratio FVIII:C/VWF:Ag est toujours inférieur à 0,6 et c’est le test de liaison du VWF au FVIII (VWF:FVIIIB) objectivant une fixation inférieure à 15% qui confirme le diagnostic.

Maladie de Willebrand type 3

Le type 3 est lié à un déficit quantitatif total en VWF et sa transmission génétique est récessive. C’est indiscutablement la forme la plus sévère, à l’origine d’un syndrome hémorragique important pouvant menacer le pronostic vital. La majorité des parents de patients de type 3 n’ont aucune symptomatologie hémorragique et souvent aucun déficit franc en VWF. Les mécanismes à l’origine du type 3 reposent sur des délétions partielles ou totales  du gène du VWF mais aussi sur des mutations non sens, des décalages du cadre de lecture, des anomalies d’épissage ou rarement des mutations faux sens. Le diagnostic de type 3 est assez facilement porté devant la constatation de taux de VWF (VWF:Ag et VWF:RCo) inférieurs à 5 UI/dl et d’un déficit profond en FVIII (généralement 1 à 10 UI/dl). Dans moins de 10% des cas (essentiellement délétions génétiques), les patients de type 3 peuvent développer un allo-anticorps anti-VWF après traitement substitutif [26]; ces allo-Ac pouvant être à l’origine de réactions anaphylactiques. L’intérêt de l’analyse moléculaire du gène du VWF chez les patients de type 3 est double : reconnaitre précocement les patients à risque de développement d’allo-Ac et faciliter le diagnostic anténatal lorsque celui-ci est recevable.

Traitement de la maladie de Willebrand: outils et grands principes

Selon le type de déficit en VWF et le type de circonstances thérapeutiques, le traitement des patients atteints de VWD est extrêmement variable allant de l’abstention thérapeutique jusqu’à la mise en œuvre de traitements lourds et complexes. La majorité des approches thérapeutiques sont basées sur la correction du déficit en VWF et/ou en FVIII grâce à des produits spécifiques : la desmopressine et les concentrés en VWF. D’autres traitements qui ne seront pas détaillés dans ce chapitre, exercent une action indépendamment de la concentration en VWF ou FVIII (antifibrinolytiques, oestroprogestatifs, hémostatiques d’appoint) et peuvent être employés seuls ou en association avec les traitements spécifiques.

La desmopressine (1 deamino-8-D-arginine vasopressine ou dDAVP) est un analogue synthétique de la vasopressine (agoniste des récepteurs V2) qui induit la sécrétion du VWF endogène stocké dans les cellules endothéliales et parallèlement une augmentation du taux de FVIII. La desmopressine utilisable en France dans la VWD se présente sous 2 formes : une forme parentérale MINIRIN® (injection IV) et une forme en spray nasal OCTIM®. L’injection IV de desmopressine (0,3 µg/kg) induit chez des sujets normaux une augmentation du taux de VWF plasmatique d’environ 3 fois le taux de base dans un délai de 30 à 60 minutes et un retour au taux de base en 6 à 9 heures [27]. La réponse à la desmopressine est reproductible chez un même individu mais il existe une variabilité inter-individus. Chez les patients atteints de VWD, il est donc capital de réaliser un test thérapeutique à la desmopressine (privilégier le test au MINIRIN® car l’OCTIM® donne des réponses moins reproductibles) avant la première utilisation clinique, idéalement dès la connaissance du diagnostic. L’évaluation biologique de la réponse est réalisée à T0, T1h, T2h et T4h (éventuellement T6h) après la fin de l’injection (0,3 µg/kg dilué dans 50 ml de sérum physiologique,  injecté par voie IV en 30 minutes) et le panel de tests suivants est réalisé pour chaque temps: numération plaquettaire, FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo et éventuellement TO PFA100®. Les critères biologiques de réponse évalués à T2h [28] sont les suivants : réponse complète s’il y a une augmentation du FVIII:C et du VWF:RCo à des taux supérieurs ou égaux à 50 UI/dl ;  réponse partielle s’il y a une augmentation du FVIII:C et du VWF:RCo d’au moins 3 fois le taux de base mais à des taux inférieurs à 50 UI/dl ; réponse insuffisante dans tous les autres cas. La desmopressine est habituellement efficace dans le type 1 de VWD (notamment lorsque la physiopathologie relève d’un défaut de synthèse du VWF alors que la réponse est éphémère quand il existe une augmentation de la clairance du VWF) et occasionnellement efficace dans le type 2N de VWD. En revanche, elle n’est généralement pas efficace dans les autres types de VWD (toujours inefficace dans le type 3) et elle est même contre-indiquée dans le type 2B (risque d’apparition ou de majoration d’une thrombopénie) à l’exception du type 2B « New York/Malmö » [28]. En thérapeutique, les injections de desmopressine peuvent être répétées toutes les 12 à 24 heures mais un phénomène de tachyphylaxie s’installe dès la 2ème ou 3ème injection ce qui en limite l’utilisation en cas de nécessité d’un traitement prolongé. Enfin, les effets secondaires liés à son effet vasomoteur (céphalées, flush facial, variations de la tension artérielle, tachycardie) et à son effet antidiurétique (hyponatrémie pouvant conduire au coma) sont à considérer pour en limiter voire en contre-indiquer l’utilisation chez les sujets âgés, les sujets avec des antécédents cardiovasculaires [29] et les enfants de moins de 2 ans.

Les concentrés de VWF disponibles en France sont le WILFACTIN® (VWF seul)  et le WILSTART® (VWF et FVIII dans un rapport FVIII/VWF de 0,5) fractionnés à partir de plasma de donneurs de sang bénévoles prélevés en France. La préparation de ces médicaments dérivés du sang comporte 3 étapes de sécurisation: traitement par solvant-détergent, nanofiltration à 35 nm et chauffage à sec. Depuis 2015, un nouveau concentré plasmatique mixte de VWF et de FVIII (rapport FVIII/VWF de 0,42), le VONCENTO®, a obtenu l’AMM en France dans le traitement et la prévention des saignements liés à une VWD.  Ces médicaments sont réservés aux pharmacies des établissements de santé et figurent sur la liste des médicaments innovants et coûteux ; leur prescription se fait en concertation avec un médecin spécialisé dans la prise en charge des patients atteints de maladie hémorragique. Le traitement par apport exogène de VWF est efficace dans toutes les formes de VWD mais en pratique, il doit être réservé au traitement curatif ou préventif de la VWD lorsque la desmopressine est inefficace ou contre-indiquée. C’est la pharmacologie du produit qui conditionne le schéma posologique : l’injection de 1 UI/kg de VWF augmente immédiatement le taux de VWF:RCo de 2 UI/dl ce qui induit une remontée progressive du taux de FVIII endogène dans un délai de 6 à 12 heures (le pic étant atteint en 12 à 24 heures). En chirurgie et dans les situations hémorragiques graves, on cherche à obtenir des taux de VWF:RCo et de FVIII:C de 100 UI/dl au pic, maintenus supérieurs ou égaux à 50 UI/dl jusqu’à cicatrisation [14, 30, 31]. En général, les posologies initiales sont de 40 à 60 UI/kg dans les formes sévères et de 20 à 40 UI/kg dans les déficits plus modérés ; les injections sont répétés toutes les 24 heures en moyenne (toutes les 12 heures dans le(s) premier(s) jours dans les formes sévères) puis espacées toutes les 48 heures. L’adaptation de la posologie repose sur la surveillance biologique des taux de FVIII et de VWF, en sus de la réponse clinique. Les effets indésirables des concentrés de VWF sont très rares : thromboses veineuses profondes parfois compliquées d’embolie pulmonaire chez des patients dont le taux de FVIII:C post-thérapeutique était supérieur à 150 UI/dl [32] et allo-anticorps anti-VWF chez des patients atteints de VWD de type 3 présentant des délétions importantes voire totale du gène du VWF [26].

Conclusion

Identifiée depuis un peu moins d’un siècle, la VWD a bénéficié, au cours des 40 dernières années, d’une avancée considérable dans la compréhension de ses mécanismes, son diagnostic et sa prise en charge thérapeutique. Un sous-comité spécifiquement consacré au VWF et à la VWD est extrêmement actif au sein de l’ISTH (International Society of Thrombosis and Haemostasis) et s’articule avec plusieurs groupes de travail européens et nationaux. La structuration du groupe français autour de cette thématique initiée et développée dans les années 1990 grâce au réseau Inserm sur la VWD de type 2 s’est renforcée en 2006 grâce à la labellisation d’un Centre National de Référence (CRMW) par le premier Plan National Maladies Rares du Ministère de la Santé. Cette reconnaissance des formes les plus graves de VWD au sein d’un concept de maladie rare a permis notamment d’en optimiser l’offre de soins (maillage territorial des Centres de Compétences), d’individualiser une commission de patients atteints de VWD au sein de l’Association Française des Hémophiles (AFH), de développer une plateforme de diagnostic phénotypique et génotypique dont la prestation nationale est réalisée dans le cadre d’une biologie experte supra-groupe hospitalier, d’initier la rédaction de référentiels spécifiques sous l’égide des sociétés savantes (GEHT/SFH/COMETH) et de renforcer l’interface entre la recherche fondamentale et la recherche clinique.

Ainsi, une cohorte de 1167 patients Français, issus de 670 familles, recrutés de 2006 à 2012 par le CRMW grâce à une étroite collaboration avec ses centres de compétences et d’autres CHU du réseau de soins adossé au maillage territorial, a fait l’objet d’une publication dans la revue Medicine (Baltimore) en mars 2016 [33]. Cette étude donne une nouvelle photographie épidémiologique de la VWD: la répartition des formes les plus graves de VWD (sélectionnées sur la base de critères phénotypiques biologiques correspondant aux types 3, types 1 « sévère » et types 2) montre une prédominance du type 2 à 66% alors que la fréquence du type 1 est de 25% et celle du type 3 de 8% (1% de type « indéterminé »). L’étude de corrélation phénotype/génotype réalisée chez ces patients met également en lumière la complexité des mécanismes physiopathologiques du déficit génétique en VWF.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Pathologies plaquettaires constitutionnelles

 

Définition

 

Les thrombopénies et thrombopathies congénitales correspondent à des anomalies quantitatives et qualitatives des plaquettes résultant d'anomalies génétiques. Ces défauts peuvent être à l'origine de symptômes hémorragiques cutanéomuqueux (Nous ne parlerons pas ici des défauts plaquettaires héréditaires associés à un risque thrombotique). Ils sont isolés et plus rarement associés à d'autres anomalies, hématologiques ou extra-hématologiques. Ils constituent un groupe de pathologies rares progressivement mieux identifiées grâce à une meilleure connaissance des constituants des plaquettes et de la mégacaryocytopoïèse et à l’utilisation des techniques de séquençage de nouvelle génération. Une cinquantaine de gènes sont à l’origine de ces pathologies. Toutefois, un grand nombre de ces pathologies reste encore inexpliqué. La prévalence de ces défauts varie en fonction de l’étiologie. Elle est d’environ 1 à 5/1 000 000 d’individus.

Les thrombopathies associées à un défaut de l'agrégation plaquettaire en dehors de toute thrombopénie

 

Les thrombopathies correspondent à un groupe hétérogène d’anomalies dont le diagnostic met très souvent en première ligne l’interprétation des résultats de l’agrégation plaquettaire réalisée in vitro sur un plasma riche en plaquettes (PRP) citraté.

 

On distingue

Les défauts d'agrégation en réponse à une majorité d'agonistes excepté à la ristocétine

Le défaut est lié à une absence ou à une forte réduction de la liaison du fibrinogène à son récepteur plaquettaire, la GPIIbIIIa. Le syndrome hémorragique est en règle générale sévère.

Le déficit quantitatif de GpIIbIIIa à la surface des plaquettes constitue la thrombasthénie de Glanzmann et est facilement confirmé par la mesure de la GPIIbIIIa en Cytométrie.

· L’existence d’un défaut d’agrégation à tous les agonistes avec une expression normale de GPIIbIIIa en cytométrie de flux oriente vers trois possibilités.

· Une anomalie qualitative de la GPIIbIIIa qui l’empêche de se lier au fibrinogène constituant le variant de thrombasthénie de Glanzmann.

· Une GPIIbIIIa normale mais incapable de s’activer en raison d’un défaut de signalisation « inside out » par déficit en kindline 3 ou en CalDAG-GEFI. La kindline 3 s’associe à la GPIIbIIIa et est requise pour son activation. L’agrégation plaquettaire est absente à la plupart des agonistes excepté au TRAP qui, à forte dose, induit une agrégation de bas niveau (30%). Ce défaut s’accompagne d’un déficit immunitaire sévère par défaut d’activation des intégrines leucocytaires identifié sous le nom de LADIII. CalDAG-GEF1 est un facteur d’échange de la GTPase monomérique, Rap1. L’agrégation plaquettaire est fortement réduite lorsque les plaquettes sont stimulées par de faibles doses d’agonistes (ADP, TRAP, AA, adrénaline). La voie de CalDAG-GEF1 est compensée et l’agrégation plaquettaire normale si de fortes doses de TRAP (50μM) sont utilisées ou lors d’activation directe de la PKC (PMA).

 

Défaut spécifique de réponse à un agoniste

Défaut d’agrégation au collagène : 

Ce défaut oriente majoritairement vers un déficit constitutionnel ou acquis (autoanticorps) en GPVI ou de la voie de signalisation en aval de

GPVI. L’agrégation plaquettaire peut être totalement absente, ou seulement réduite. Le CRP ou peptide activateur issu du collagène et la convulxine (venin de serpent) sont des agonistes spécifiques de la GPVI permettant d’évaluer la voie GPVI sans mettre en jeu la GpIa/IIa. Les défauts constitutionnels ou acquis en GPIa-IIa et ceux en rapport avec les voies de signalisation en aval de GPVI sont exceptionnels. Toutefois, de nouvelles thérapeutiques ciblées (inhibiteurs de Src, de Syk, ou de Btk) utilisées dans le traitement d’hémopathies malignes inhibent l’agrégation au collagène en interférant avec les voies de signalisation.

 

 Défaut de réponse à la ristocétine

 Le pseudo-Willebrand plaquettaire est dû à des mutations qui augmentent l’affinité de la GpIba pour le facteur Willebrand normal, l’agrégation à la ristocétine à faible dose (≤ 0,6 mg/ml) est présente. Une thrombopénie accompagne en général cette pathologie mais la numération plaquettaire peut être normale. La réalisation d’épreuves croisées permet de différencier le pseudowillebrand du variant 2b de la maladie de Willebrand (persistance de l’agrégation à faible dose de ristocétine du mélange plaquettes du patient et plasma normal).

 

Défaut prédominant mais non exclusivement sur la réponse à un agoniste

Anomalie du récepteur à l’ADP, P2Y12

Les plaquettes expriment plusieurs récepteurs purinergiques. L’agrégation induite par l’ADP explore la voie P2Y1/Gq, voie «starter», à l’origine d’une augmentation de la concentration de calcium intracellulaire et d’un changement de forme des plaquettes et la voie d’activation/amplification P2Y12/Gi. L’activation de P2Y12 inhibe aussi les voies de rétrocontrôle négatif de l’agrégation plaquettaire, essentiellement médiées par l’AMPc produit par l’adénylate cyclase (AC). Ce rétrocontrôle est impliqué dans la croissance du thrombus in vivo mais n’est pas exploré par l’agrégation plaquettaire en PRP classiquement réalisée en routine.

L’ADP secrété des granules d est un amplificateur de l’activation plaquettaire induite par des concentrations sous-optimales d’autres agonistes. A forte concentrations d’agonistes la boucle d’amplification de l’ADP n’est plus utile pour induire une agrégation optimale in vitro.

Chez les patients porteurs d’une mutation délétère du récepteur P2Y12 à l’état homozygote ou hétérozygote composite, l’agrégation n’est pas induite par l’ADP même à très forte dose (100μM). L’agrégation est réduite en réponse à de faibles doses de collagène, soulignant le rôle amplificateur important de l’ADP dans des conditions de faible stimulation. Ce phénomène n’est pas observé avec de fortes doses de collagène ou de TRAP. Le porteur de mutation à l’état hétérozygote présentera en général un tableau intermédiaire avec une agrégation quasi normale ou qui s’améliore à fortes doses. L’utilisation de plaquettes lavées peut sensibiliser le diagnostic. La détection des hétérozygotes peut nécessiter la réalisation de méthodes sensibilisées basées sur la mesure de la production d’AMPc.

 

 Défaut sur la voie du Thromboxane A2 (TXA2)

Le TXA2 produit par la transformation de l’acide arachidonique (AA) endogène ou exogène exerce son effet via un récepteur spécifique (TPα ou TXA2R) couplé aux protéines Gq et G12/13. Cette voie correspond à un mécanisme d’amplification essentiel pour obtenir l’agrégation aux faibles concentrations de nombreux agonistes, notamment à l’adrénaline et à l’ADP.

Le défaut de réponse à l’AA est, le plus souvent, lié un défaut de conversion de l’AA exogène en TXA2 dû à la prise d’inhibiteurs de COX1 comme les anti-inflammatoires non stéroidiens ou l’aspirine. Il n’a pas été reporté à ce jour d’anomalie des gènes de COX1 ou prostaglandin G/H synthase 1 (PGHS1). Les mutations décrites touchent majoritairement le récepteur TPa. L’utilisation d’analogues du TXA2 comme l’U46619 et le dosage du TXB2 (métabolite stable du TXA2) dans le sérum permettent de distinguer ces deux mécanismes. Dans le premier cas, l’agrégation induite par les analogues du TXA2 est normale et le TXB2 sérique est très bas. Dans le deuxième cas l’agrégation induite par l’U46619 est profondément affectée.

Des mutations du gène TBXAS1 qui code pour une thromboxane synthase ont été retrouvées chez des patients atteints de dysplasie hémato-diaphysaire de Ghosal associée à des défauts de réponse plaquettaire à l’AA alors que l’agrégation induite par le U46619 est normale.

 

Anomalie de l'agrégation plaquettaire par défaut des granules

Les défauts touchant les granules denses se caractérisent par une réduction de l’agrégation plaquettaire aux faibles doses d’agonistes en accord avec une réduction du rôle amplificateur de l’ADP. Mais quelques caractéristiques sont à souligner : le défaut d’agrégation à l’ADP 10 μM est en règle générale modéré laissant supposer que la sécrétion influence peu l’agrégation induite par l’ADP lui-même. La réponse au collagène faible dose est, par contre, fortement réduite. La réponse aux faibles doses d’épinéphrine est très souvent anormale.

Les formes syndromiques (Hermansky Pudlack, Griscelli, Chediak Higashi) sont des désordres autosomiques récessifs souvent évoqués devant la présence d’un albinisme. Les déficits en granules denses non syndromiques sont plus fréquents et probablement sous-estimés car le syndrome hémorragique spontané est en général modéré voire inexistant. Il est important de souligner que l’agrégation plaquettaire peut être normale ou peu perturbée. Une batterie de tests complémentaires doit être mise en oeuvre pour consolider le diagnostic avec en particulier la quantification de composants intragranulaires et le comptage des granules denses en microscopie électronique. Ceci peut permettre d’identifier des défauts quantitatifs ou qualitatifs.

 

-L’ARC syndrome associe une arthrogrypose, une atteinte rénale et une cholestase et des troubles du développement. D’autres signes peuvent compléter le tableau clinique (ichtyose, atteintes neurologiques, atrophie musculaire, diabète insipide, anémie, diarrhée). Cependant des formes incomplètes existent et le diagnostic peut s’avérer difficile. Elle est due majoritairement à une atteinte du gène VPS33B (pour « Vacuolar protein sorting-associated protein 33B ») qui intervient dans la genèse des granules alpha plaquettaires notamment dans le trafic vésiculaire. Le gène VIPAR (VPS 33B interacting protein) est également à l’origine de ce syndrome. Ces patients présentent une tendance hémorragique en particulier provoquée à l’occasion des biopsies nécessaires au suivi hépatique et rénal.  Les frottis sanguins vont révéler des plaquettes pâles, l’agrégation plaquettaire à l’ADP et à l’AA est diminuée.

 

Thrombopathies constitutionnelles de mécanisme incertain ou incomplètement caractérisées

  • Défaut isolé de réponse à l’épinéphrine : Le défaut de deuxième vague en réponse à l’épinéphrine serait présent chez 10 à 15% des sujets normaux en rapport avec un nombre réduit de récepteurs a2A. Ce défaut a également été décrit au cours du syndrome Québec sans que le mécanisme ne soit élucidé.
  • Déficit en Galpha q :  Un déficit de 25% de Galphaq a été mis en évidence dans une famille mais n’a pas, pour l’instant, été associé à une anomalie moléculaire.
  • Défaut de phospholipase C beta :  Pour ces patients l’agrégation plaquettaire était réduite pour la plupart des agonistes. Aucune anomalie moléculaire n’est venue étayer cette hypothèse.
  • Défaut portant sur le récepteur P2X1 : Une forme dominante négative du récepteur s’associerait à un défaut sélectif d’agrégation à l’ADP sans anomalie de l’agrégation à l’acide arachidonique, au TRAP14 et à la ristocétine. Les tracés d’agrégation plaquettaire du patient porteur de l’anomalie n’ont pas été rapportés dans la publication relative à ce cas.
  • Le syndrome de Noonan associe des anomalies du squelette, une petite stature et des malformations cardiaques et génitales. Dans la majorité des cas les mutations touchent le gène PTPN11 et plus rarement les gènes SOS1 et KRAS. La moitié de ces patients souffrent de manifestations hémorragiques spontanées ou provoquées. Les saignements ont été attribués à des anomalies de la coagulation mais également à une diminution de l’activation et de la sécrétion plaquettaires en réponse à une grande majorité d’agonistes (ADP, collagène, TRAP, AA).
  •  

Les thrombopahies n'affectant pas l'agrégation plaquettaire réalisée en routine

 

Hyperactivation de la voie inhibitrice de l’activation plaquettaire : Déficit en Galpha s(Gs).

 

Une tendance aux saignements a été décrite chez des patients présentant une hyperactivité de la voie Gs liée à une insertion de 36pb dans le gène codant pour la sous unité extralarge de Gs. La transmission est uniquement paternelle. Ces cas sont associés à un retard mental, une épilepsie et des anomalies modérées du squelette. L’agrégation plaquettaire est normale alors que le temps de saignement est fortement allongé. Le diagnostic de ces cas passe par la mise en évidence d’une inhibition majorée de l’agrégation plaquettaire par la PGI2 et la PGE1.

 

Le syndrome Quebec

a été rapporté chez plusieurs sujets d’origine franco-canadienne. Il se caractérise le plus souvent par des saignements post-opératoires retardés ou post-traumatiques. Il s’accompagne dans 50% des cas d’hématuries et de saignements articulaires moins fréquents. Il est lié à une accumulation de l’urokinase (u-PA produit du gène PLAU) dans les granules alpha, qui active le plasminogène en plasmine, ce qui conduit à la protéolyse des protéines intragranulaires. Le dosage de l’urokinase dans le plasma et le lysat plaquettaire constitue un très bon outil diagnostique de même que le dosage des D-Dimères dans le sérum. Les manifestations hémorrragiques sont contrôlées par l’administration d’antifibrinolytiques.

 

Le syndrome de Scott

correspond à des patients dont les plaquettes n’exposent plus de phosphatidyl serine (PS), même en réponse à une activation forte associant deux agonistes : la thrombine et le collagène. L’activité procoagulante de ces plaquettes est donc très réduite. Des mutations du gène TMEM16F ont été identifiées à l’origine de cette pathologie. La protéine TMEM16F possède la double fonction de canal ionique et de scramblase. Cette pathologie rare est évoquée devant le défaut de consommation de prothrombine dans le sérum non corrigée par l’ajout de plasma normal, et diagnostiquée par CMF en mesurant la capacité des plaquettes à exposer les PS en réponse au ionophore calcique ou à un mélange de thrombine et de collagène.  Des tests de génération de thrombine en PRP peuvent compléter l’analyse.

 

Les thrombopénies

 

Les thrombopénies d’origine génétique forment un ensemble très hétérogène en particulier sur le plan pronostique. Ces patients font souvent l’objet d’une errance diagnostique avec un risque de mauvaise prise en charge thérapeutique. Le diagnostic repose sur un faisceau d’arguments cliniques (antécédents personnels et familiaux) et des signes biologiques au premier rang desquels les anomalies morphologiques des plaquettes voire des mégacaryocytes.

Les mutations responsables sont majoritairement localisées dans des gènes impliqués dans la mégacaryocytopoïèse. La thrombopénie n’aura pas les mêmes caractéristiques en fonction de la phase sur laquelle agit le variant. Ainsi, les variants des facteurs régulant la phase précoce de la mégacaryocytopoïèse donc agissant sur la cellule souche et les progéniteurs entraineront une diminution voire une absence de mégacaryocytes médullaires. Les variants touchant les facteurs de la phase endomitotique et de maturation cytoplasmique ne modifieront pas le nombre de mégacaryocytes (ou alors dans le sens d’une augmentation) mais ne permettront pas leur maturation, d’où la présence de mégacaryocytes de petite taille hypolobulés avec un contenu en granules α diminué. Enfin, les variants des facteurs gouvernant la plaquettogenèse seront responsables d’une thrombopénie à grosses ou petites plaquettes mais avec une maturation normale des mégacaryocytes.

Classification

La classification la plus répandue des thrombopénies constitutionnelles est celle basée sur la taille plaquettaire évaluée par la mesure du volume plaquettaire moyen (VPM) par les automates ou la mesure de la taille des plaquettes en microscopie sur frottis sanguin coloré au May-Grünwald-Giemsa. On distingue trois groupes : le groupe 1 avec des macroplaquettes ou des plaquettes géantes (Diamètre entre 4 et 8 µm ou > 8µm respectivement), le groupe 2 avec des plaquettes de taille normale (entre 4 et 8 µm) et le groupe 3 avec des plaquettes de petite taille (< 4µm). D’autres classifications prennent en considération la présence ou non de manifestations extra-hématologiques (thrombopénies syndromiques). (cf table)

  • Thrombopénies causées par un défaut de la phase précoce de la mégacaryocytopoïèse.

Les variants affectant cette phase entrainent un défaut quasi complet de mégacaryocytopoïèse. Les principales conséquences sont la présence d’une thrombopénie majeure dès la naissance pouvant parfois se corriger et l’absence ou la raréfaction des mégacaryocytes au myélogramme. Par un mécanisme de rétro-contrôle, les taux de TPO sérique sont très élevés.

On identifie dans ce groupe : La thrombopénie par amégacaryocytopoïèse congénitale (CAMT), la thrombopénie avec absence de radius (TAR syndrome) qui peut s’améliorer avec l’âge, la thrombopénie avec amégacaryocytopoïèse et synostose radio-cubitale (CTRUS ou RUSAT).

  • Thrombopénies causées par un défaut de la phase d’endomitose des mégacaryocytes.

Les variants affectant cette phase entrainent un défaut de maturation nucléaire des mégacaryocytes. Les thrombopénies résultant de ces variants sont variables mais plutôt modérées et normocytaires ou faiblement macrocytaires. Le nombre de mégacaryocytes médullaires est normal mais on note une immaturité morphologique avec des mégacaryocytes hypolobulés et présentant parfois un contenu en granules α diminué. Par ailleurs, certaines de ces thrombopénies sont associées à un risque accru de développer des hémopathies.

On identifie dans ce groupe : la thrombopénie familiale avec prédisposition aux leucémies aiguës (FPD/AML) due à des mutations du gène RUNX1, les anomalies du gène FLI1 incluant la thrombopénie Paris-Trousseau (TCPT) et le syndrome de Jacobsen (JBS) responsables de granules alpha géants et d’un déficit en granules denses, la thrombopénie liée à ETV6 qui s’associe à une élévation des cellules CD34+ circulantes et à des troubles de la maturation du GR, les thrombopénies avec mutation de GATA1 associées à des défauts granulaires et  pouvant s’associer à une dysérythropoïèse (XLTDA) ou une β-thalassémie (XLTT), le syndrome des plaquettes grises lié à des mutations sur le gène NBEAL2 ou GFI1B, la thrombopénie liée à des mutations sur le promoteur de ANKRD26 l’empêchant de lier RUNX1. Des mutations de SALL4 sont responsables du syndrome oculo oto radial ou syndrome IVIC associant des anomalies osseuses à un strabisme et un déficit auditif. Il s’accompagne dans certains cas d’une thrombopénie légère.  

Récemment une mutation homozygote dans le gène FYB a été identifiée responsable d’une thrombopénie à microplaquettes et associée à un défaut de différenciation des mégacaryocytes et une diminution des mégacaryocytes matures dans la moelle osseuse. Ce gène code pour la protéine ADAP (adhesion and degranulation-promoting adaptor protein) spécifique à l’hématopoïèse et impliquée dans l’activation et l’adhésion plaquettaires.

 

  • Thrombopénies causées par un défaut de plaquettogenèse.

Les variants affectant cette phase entrainent une maturation mégacaryocytaire quasiment normale. Seule la formation des proplaquettes est altérée conduisant à des thrombopénies variables avec une taille plaquettaire anormale (le plus souvent macrocytaire). Les mégacaryocytes médullaires sont donc normaux.

On identifie dans ce groupe :

 Les syndromes MYH9 conduisent à des macrothrombopénies avec un fort pourcentage de plaquettes géantes. MYH9 code pour la chaîne lourde de la myosine IIA non musculaire (NMMHC-IIA) qui est une protéine motrice contractile du cytosquelette impliquée dans les processus de migration, de cytocinèse et de maintien de la forme cellulaire. Parmi ces syndromes, les syndromes de May-Hegglin et de Sebastian sont caractérisés exclusivement par la présence d’inclusions leucocytaires de différentes tailles appelées corps de Döhle alors que les syndromes d’Epstein et de Fechtner associent aux corps de Döhle la présence d’une surdité, d’une néphrite et/ou d’une cataracte. Ces macrothrombopénies se caractérisent par un fort pourcentage de grandes plaquettes (30-40%> 97eme percentile d’une distribution contrôle). La recherche d’agrégats de myosine dans les polynucléaires neutrophiles en immunofluorescence est une aide précieuse au diagnostic.

Les atteintes du complexe GPIb/V/IX conduisent à des macrothrombopénies. On distingue le syndrome de Bernard-Soulier bi-allélique. Le diagnostic biologique est basé sur la mise en évidence d’un fort pourcentage de grandes plaquettes (30-40%> 97eme percentile d’une distribution contrôle), d’une réduction voire d’une absence totale d’agrégation plaquettaire à la ristocétine et du complexe glycoprotéique à la surface des plaquettes par cytométrie de flux ; le syndrome de Bernard Soulier mono-allélique est de diagnostic plus difficile. Le VPM est moins élevé que dans les formes bi-alléliques. Le diagnostic est essentiellement moléculaire car l’agrégation à la ristocétine ainsi que l’expression du complexe GPIb/V/IX sont très faiblement réduits. Le syndrome de DiGeorge ou syndrome vélo-cardio-facial (VCFS) est dû à une délétion hémizygote située en 22q11.2. Cette délétion emporte le gène GPIBB et entraîne une macrothrombopénie comparable à celle observée dans le syndrome de Bernard Soulier mono-allélique. L’ensemble de la symptomatologie extra-hématologique dépend de la taille de la région délétée. La maladie de pseudo-Willebrand plaquettaire (PT-VWD) résulte d’une mutation gain de fonction dans le gène de la GPIBA conduisant à une augmentation d’affinité du complexe GPIb/V/IX pour le facteur von Willebrand. Le diagnostic doit être évoqué devant une macrothrombocytopénie et une agrégation plaquettaire à de faibles doses de ristocétine (0.5 mg/mL).

Le syndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) est causé par des variants de la protéine WASp impliquée dans la polymérisation de l’actine. Les variants du gène WAS sont responsables de plusieurs syndromes : le WAS avec déficit immunitaire, la thrombopénie isolée liée à l’X (XLT) et une forme rare de neutropénie associée à des syndromes myélodysplasiques sans thrombopénie. La thrombopénie peut être modérée à sévère avec des plaquettes de petite taille (VPM < 7 fL).

 La thrombopénie liée à l’α-actinine 1 (ACTN1), protéine impliquée dans l’organisation du cytosquelette, donc dans la formation des proplaquettes.

La filamine A est une protéine se liant aux filaments d’actine par l’intermédiaire de la GPIbα, régulant ainsi la formation des proplaquettes et la taille des plaquettes. Certains cas de mutations sur FLNAou sur TUBB1 sont associés à des macrothrombopénies,

Les thrombopénies liées à ITGA2B/ITGB3. Certaines mutations mono-alléliques gain de fonction ont été décrites comme responsables de macrothrombopénies. Le diagnostic doit être évoqué devant une diminution d’expression du complexe GPIIb/IIIa à la surface plaquettaire associée à une fixation spontanée et anormale du fibrinogène et de l’anticorps PAC1 (reflet de l’activation du complexe).

La thrombopénie liée à CYCS. La voie apoptotique intrinsèque liée au relargage du cytochrome c (CYCS) des mitochondries est essentielle à la formation des proplaquettes. Des variants de CYCS sont associés à des thrombopénies à volume normal voire diminué.

Thrombopénie et sistostérolémie. La sistostérolémie est une maladie conduisant à une accumulation de phytostérols dans le sang et dans les tissus. Les signes cliniques principaux sont la présence de xanthomes, de signes prématurés d’athérosclérose et d’arthrite. Les gènes mutés sont ABCG5 ou ABCG8, et codant respectivement pour la sterolin 1 et 2. Des cas de sistostérolémies associés à une macrothrombopénie à plaquettes géantes avec hémolyse stomatocytique et splénomégalie ont été décrits.

La thrombopénie liée à PRKACG. PRKACG code pour la sous-unité catalytique γ de la protéine kinase A (PKA) dépendante de l’AMPc. PKA phosphoryle plusieurs substrats plaquettaires dont la filamine A et la GPIbβ. La phosphorylation de la filamine A la protège de la dégradation protéique. Une mutation homozygote dans PRKACG a été mise en évidence dans une famille consanguine présentant un syndrome hémorragique majeur associé à une macrothrombopénie avec thrombopathie.

La thrombopénie liée à TMPR7. TRPM7 appartient à la famille des canaux mélastatine localisés à la membrane plasmique. TRPM7 est impliqué dans la phosphorylation de plusieurs substrats et dans la régulation du stress oxydatif. Une macrothrombopénie a été décrite chez les membres d’une famille porteuse d’une mutation sur TMPR7 associée à une fibrillation auriculaire.

  •   Thrombopénies constitutionnelles autres.

Le syndrome de Stormorken est causé par une mutation dans le gène STIM1. Cette mutation entraîne la production d’une protéine constitutivement active provoquant une élévation du calcium intracellulaire via le canal calcique CRAC. Ce flux ionique anormal raccourcirait la durée de vie des plaquettes entraînant une thrombopénie et un syndrome hémorragique. Les patients présentent, par ailleurs, d’autres manifestations comme une myopathie, un myosis, une asplénie, une ichtyose et une dyslexie.

 

Démarche diagnostique

Le diagnostic définitif d’une thrombopénie constitutionnelle est réalisé dans des centres spécialisés en liaison avec le Centre de Référence des Pathologies Plaquettaires (CRPP).

En revanche, le diagnostic d’orientation peut se faire partout avec des éléments relativement simples mais méticuleux grâce à l’interrogatoire à la recherche d’une histoire familiale de thrombopénie, de son mode de transmission, de l’existence de pathologies oncohématologiques familiales, de la présence d’un syndrome hémorragique inapproprié par rapport au taux de plaquettes, d’une absence de réponse aux traitements classiques des thrombopénies auto-immunes;  à l’examen clinique objectivant ou pas des signes extra-hématologiques (surdité, néphropathie, cataracte, retard mental, malformations osseuses, …); à l’examen morphologique des éléments figurés du sang à la recherche de corps de Döhle, d’une modification de la taille des plaquettes (par des automates optiques ou par évaluation sur frottis sanguin) et d’un contenu granulaire anormal; éventuellement la réalisation d’un myélogramme apportera des éléments déterminants.

Des examens plus spécialisés seront ensuite réalisés (Cytométrie en flux, immunofluorescence, dosage sérique de la TPO,…..). Enfin une recherche génétique ciblée ou non ciblée (technique de nouvelle génération) sera mise en œuvre en fonction des éléments clinico-biologiques.

 

Telecharger la proposition de démarche diagnostique

 

Classification des principales étiologies des thrombopénies et des thrombopathies

Le mode de transmission est précisé entre parenthèse : AD : autosomique domiant, AR : autosomique récessif et lié à l'X : transmission liée à l'X

Thrombopénie non syndromique

Plaquettes géantes ou macroplaquettes (VPM augmenté)
Plaquettes à VPM normal
Plaquettes microcytaires (VPM diminué)
  • ACTN1 (AD)
  • FLNA (Lié à l'X)
  • GFI1B (AD)
  • GPIBA, GPIBB, GP9 :

biallélique (AR) monoallélique (AD) pseudowillebrand (AD)

  • ITGA2B/ITGB3 (AD)
  • MYH9 (May-Hegglin) (AD)
  • NBEAL2 (AR)
  • PRKACG (AR)
  • TUBB1 (AD)
  • TRPM7 (AD)
  • ANKRD26(AD)
  • ETV6 (AD)
  • FLI1 (AD)
  • GATA1 (lié à l'X)
  • RUNX1 (AD)
  • MPL (AR)
  • CYCS (AD)
  • WAS : XLT (lié à l'X)
  • FYB (AR)

Thrombopénie syndromique (atteinte d'organe)

  • HOXA 11 : Amégacaryocytose avec synostose radioulnaire (AD)
  • DIAPH 1 : Macroplaquette et surdité (AD)
  • Délétion 22q11 : Syndrome de Di George (AD)
  • SALL4 : Syndrome oculo oto radial ou IVIC syndrome (AD)
  • MYH9: Syndromes Epstein, Fechtner, Sebastian (AD)
  • STIM1: Syndrome de Stormorken (AD)
  • ABCG5/G8: Sitostérolémie (AR)
  • RBM8 : TAR syndrome (AR)
  • Délétion 11q23 (FLI1):Thrombopénie Paris Trousseau et Jacobsen (AD)
  • WAS: Wiskott Aldrich (Lié à l’X)
  • FLNA : thrombopénie associée à une atteinte neurologique (Lié à l’X)
  • SRC : Atteinte osseuse, édentation, myélofibrose, dysplasie des 3 lignées (AD)

 

Thrombopathie non syndromique

  • GP : défaut de réponse au collagène (AR)
  • ITGA2B/ITGB3 : maladie de Glanzmann (AR)
  • PLAU : syndrome de Quebec (AD)
  • P2RY12 : défaut majoritaire à l'ADP (AR)
  • RASGRP2 (CalDAG-GEF1) : défaut d'activation de la GP IIbIIIa (AR)
  • TNEM16F (AN06) : syndrome de Scott (AR)
  • TBXA2R : défaut de réponse à l'AA et aux agonistes spécifiques du récepteur (AD)

Thrombopathie syndromique

  • HSP1-3-4-5-6, BLOC1S3 et 1S6, DTNBP1, AP3B1 : Syndrome de Hermansky-Pudlak (AR)
  • LYST : syndrome de Chediak-Higashi (AR)
  • RAB 27 : syndrome Griscelli (AR)
  • TBXAS1 : syndrome de Ghosal (AR)
  • PTPN11 et autres gènes associés : Syndrome de Noonan (AD)
  • FERMT3 : LADIII (AR)
  • GNAS (Gs) : anomalies du squelette (transmission paternelle)
  • VPS33B : ARC syndrome (AR)
  • VIPAR : ARC syndrome (AR)

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Publications

Vous trouverez sur le site networkxpert  des articles de mise au point, des comptes-rendus de réunions concernant l'hémophilie, la maladie de Willebrand et leurs traitements.

 

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